Tháng 11/1940, Hội nghị Ban Chấp hành Trung ương Đảng tiến hành họp và đi đến quyết tạm dừng chỉ cuộc khởi nghĩa Nam Kỳ vì điều kiện chưa chín muồi, nhưng khi đồng chí Phan Đăng Lưu về đến Sài Gòn thì ngày 21/11 Thường vụ Xứ ủy đã phát lệnh thông báo cho các cấp cuộc khởi nghĩa được bắt đầu vào lúc 24 giờ ngày 22/11/1940, vì thế Cuộc khởi nghĩa không thể hoãn lại nữa.

Đêm 22 rạng sáng ngày 23 tháng 11 năm 1940, dưới sự lãnh đạo của các Đảng bộ Nam kỳ, cuộc khởi nghĩa nổ ra ở hầu khắp các tỉnh từ miền Đông đến miền Tây Nam Bộ, đặc biệt, diễn ra rất quyết liệt ở Hóc Môn (Bà Điểm, Gia Định), Cai Lậy (Mỹ Tho), Vũng Liêm. Cả vùng nông thôn rung chuyển trước sức mạnh tiến công của quần chúng cách mạng. Nhiều đồn bốt, công sở, đường giao thông... của địch bị phá. Tại một số xã, quận, chính quyền địch hoang mang, tan rã, chính quyền cách mạng được thành lập, tịch thu ruộng đất của địa chủ và phản động để chia cho dân cày nghèo, đồng thời trừng trị bọn phản cách mạng... Đây cũng là lần đầu tiên, cờ đỏ sao vàng được xuất hiện trong nhiều cuộc biểu tình và ở những nơi đã thành lập chính quyền cách mạng.

Vì kế hoạch của cuộc khởi nghĩa bị lộ nên thực dân Pháp đã kịp thời chuẩn bị để đối phó, cuộc khởi nghĩa bị khủng bố vô cùng tàn khốc. Hàng chục xe chở đầy lính được tung đi truy lùng lực lượng du kích, càn quét các vùng khởi nghĩa. Nhiều máy bay được huy động đi ném bom các vùng có quần chúng nổi dậy, như: Năm Thôn, Cai Lậy, Chợ Giữa, Càng Long... Trong thời gian từ ngày 23/11/1940 đến ngày 31/12/1940, ở các tỉnh, như: Gia Định, Mỹ Tho, Cần Thơ, Long Xuyên, thực dân Pháp bắt hơn 5.000 người, trong đó hàng ngàn người bị xử tử, bị đày ra Côn Đảo, đi các trại tập trung Tà Lài, Bà Rá. Lực lượng nghĩa quân ít ỏi còn lại rút về Truông Mít (Thủ Dầu Một), Bình Hòa, Bình Thành trong vùng Đồng Tháp và rừng U Minh để củng cố lực lượng.

Vì thời cơ chưa đến, khởi nghĩa Nam Kỳ đã thất bại. Song, cuộc khởi nghĩa thể hiện lòng căm thù sâu sắc của nhân dân với thực dân, tinh thần anh dũng quật khởi của quần chúng cách mạng. Cuộc khởi nghĩa Nam Kỳ cùng với cuộc khởi nghĩa Bắc Sơn là những tiếng súng báo hiệu cho cuộc khởi nghĩa toàn quốc, là bước đầu đấu tranh bằng vũ lực của các dân tộc Đông Dương.

Tinh thần của Cuộc khởi nghĩa Nam kỳ là tinh thần quật khởi của dân tộc, tinh thần “vì nước, vì dân”, tinh thần cách mạng tiến công không ngừng, quyết đi tới mục tiêu cuối cùng để mang lại độc lập, tự do cho Tổ quốc, ấm no, hạnh phúc cho nhân dân. Tinh thần quật khởi của đồng bào, chiến sĩ khởi nghĩa Nam kỳ đã góp phần hun đúc nên lòng dũng cảm, chí kiên cường cho Đảng ta, cho nhân dân ta trong cuộc kháng chiến chống thực dân Pháp và đế quốc Mỹ, hoàn thành sự nghiệp giải phóng dân tộc, thống nhất đất nước.